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溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基 (Cetrimide Agar Medium) 是各國藥典普遍收載的控制菌檢查固體培養(yǎng)基, 用于銅綠假單胞菌的劃線分離培養(yǎng)。首先我們看一下溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基的配方和作用：

（1）營養(yǎng)成分：銅綠假單胞菌分解蛋白質能力較強，而發(fā)酵糖類能力較低，在培養(yǎng)基組分中明膠胰酶水解物和甘油為銅綠假單胞菌的生長提供碳、氮源、維生素和生長因子。

（2）無機鹽：氯化鎂和硫酸鉀可以促進綠膿菌素的產生，并維持滲透壓。

（3）選擇性培養(yǎng)的原理：溴化十六烷基三甲銨(cetrimide)作為一種季銨鹽陽離子表面活性劑，通過改變細菌細胞的通透性，使細菌發(fā)生自溶或引起菌體蛋白質變性沉淀，導致細菌死亡，有較強的抑菌作用。銅綠假單胞菌對溴化十六烷基三甲銨有一定的耐受性，因此，被用于銅綠假單胞菌的選擇培養(yǎng)。

（4）顏色：銅綠假單胞菌生長過程中會產生兩種水溶性色素：黃色的熒光素和綠色的綠膿菌素，所以在溴化十六烷基三甲銨瓊脂平板上菌落呈黃綠色。

以疑似銅綠假單胞菌的溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)物或疑似菌分離純化的TSA培養(yǎng)物做后續(xù)生化試驗。

（1）氧化酶試驗

方法：挑取可疑菌落于潔凈的濾紙片上，滴加1%二鹽酸N，N-二甲基對苯二胺試劑，30秒內出現粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色，為氧化酶試驗陽性反應。若培養(yǎng)物不變色或僅顯粉色為陰性反應。

原理：銅綠假單胞菌含有細胞色素氧化酶，該酶是細胞色素呼吸酶系統(tǒng)的最終呼吸酶。具有氧化酶的細菌，首先使細胞色素C氧化，再由氧化型細胞色素C使對苯二胺氧化，生成有色（如粉紅色或紫紅色）的醌類化合物。

（2）綠膿菌素生成試驗

方法：挑取可疑菌落接種在在綠膿菌素測定用培養(yǎng)基（PDP）斜面上，培養(yǎng)24小時，觀察斜面有無色素。如有色素，在試管內加氯仿3.0～5.0mL，充分震搖，使培養(yǎng)物中的綠膿菌素提取在氯仿中，待氯仿提取液呈現綠色時，加1mol/L鹽酸約1mL，震搖后靜置片刻，上層鹽酸溶液中呈現粉紅至紅色實驗結果為陽性，否則為陰性。

原理：銅綠假單胞菌能產生的綠膿菌素能被氯仿提取，且在水中溶解度比氯仿大，并且會發(fā)生可逆的氧化還原反應，氧化時堿性呈藍色，酸性呈紅色。所以加入鹽酸溶液并震搖后，綠膿菌素會由氯仿轉移至鹽酸溶液中，并在酸性環(huán)境中呈紅色。
 

（3）硝酸鹽還原產氣試驗

方法：取可疑菌落接種在含小導管的硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基內，35℃培養(yǎng)24小時，小導管內有氣體產生實驗結果為陽性，否則為陰性。

原理：銅綠假單胞菌是一類兼性好氧、以有機碳作為能源的異養(yǎng)硝化菌，能通過產生的酶分四步還原硝酸鹽，將硝酸鹽分解產生氮氣。

（4）42℃生長試驗

方法：以接種環(huán)沾取少許TSA培養(yǎng)物于0.9%無菌氯化鈉溶液中，制成菌懸液。將菌懸液劃線接種于TSA斜面上，置41±1℃培養(yǎng)培養(yǎng)24-48小時，斜面上如有菌苔生長為陽性反應，無菌苔生長為陰性反應。銅綠假單胞菌生長實驗結果為陽性。

原理：致病性銅綠假單胞菌能在42℃條件下生長，同屬的熒光假單胞菌和惡臭假單胞菌都不能生長。

（5）明膠液化試驗

方法：取可疑菌落穿刺接種在明膠培養(yǎng)基內，35℃培養(yǎng)24小時，取出后放2-8度冰箱10-30min，如果仍為液體，實驗結果為陽性，否則為陰性。

原理：是利用銅綠假單胞菌產生胞外酶（明膠酶），使明膠分解為氨基酸，從而失去凝固力，半固體的明膠培養(yǎng)基成為流動的液體。

（1）供試品培養(yǎng)物經證實為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶試驗及綠膿菌素試驗皆為陽性者，即報告1g或1ml供試品檢出銅綠假單胞菌；
（2）供試品培養(yǎng)物氧化酶陽性，鏡檢革蘭氏陰性桿菌，綠膿菌素試驗陰性時硝酸鹽還原產氣試驗，42℃生長試驗及明膠液化試驗皆為陽性時，報告1g或1ml供試品檢出銅綠假單胞菌；
（3）與（1）和（2）結果不符，報告1g或1ml供試品未檢出銅綠假單胞菌。

原文鏈接：中國藥典中銅綠假單胞菌的檢驗及分離鑒定原理。